苏州大学刘庄/陈倩团队：“化学抗体”实现肿瘤免疫动态成像和治疗

苏州大学功能纳米与软物质研究院刘庄教授和陈倩教授团队利用DNA固相合成直接构建脂质修饰的核酸适配体，这种“化学抗体”制备方法简单。通过静脉注射后，脂质尾巴迅速和血清中大量存在的血清白蛋白结合，显著地提高了核酸适配体在体内的稳定性和血液循环时间，且不影响核酸适配体与靶分子的亲和力。脂质核酸适配体进一步标记放射性核素后可作为肿瘤免疫成像探针，可实时、快速地监测放疗或者化疗后肿瘤免疫指标的动态变化，用于替代临床金标准‘组织病理活检’。脂质核酸适配体也可以作为肿瘤免疫治疗分子。这项工作为临床中筛选哪些癌症病人适合免疫治疗提供了工具，同时为临床中选择肿瘤放疗/化疗与免疫治疗相结合治疗的时间窗口提供了基础，推动了核酸在生物医学领域中的应用。

免疫治疗通过唤醒宿主免疫系统摧毁癌细胞，癌症免疫治疗的时代已经来临。不同类型的免疫疗法在过去十年中取得了巨大的进步，但是对实体瘤治疗的响应率仍有待提高。基于程序性细胞死亡-1（PD-1）和程序性细胞死亡配体1（PD-L1）的免疫检查点阻断治疗被证明依赖于肿瘤中免疫标志物（如PD-L1）的表达。同时目前在临床上为获得最佳治疗效果，通常将免疫检查点阻断治疗与化疗或放疗相结合。为了预测免疫治疗以及联合治疗的疗效，各种免疫标志物（如肿瘤中PD-L1表达）的组织病理学检查已成为临床的金标准。然而肿瘤免疫标志物在治疗过程中可能会发生变化，因此通过非侵入式的活体成像方法监测免疫标志物的动态变化非常重要。在临床和临床前研究中，核素成像作为一种非侵入式的成像方法可取代传统的组织病理学检查。由于抗体长达数天甚至数周的血液循环半衰期，放射性标记的抗体通常需要几天才能获得高对比度的图像，这与成像放射性核素较短的半衰期不兼容。

单域抗体（纳米抗体）具有分子量小、体积小和血液循环时间短等特点，是目前研究的热点。核酸适配体也称为“化学抗体”，是通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选出的单链DNA/RNA寡核苷酸。核酸适配体对目标分子表现出极高的亲和力，可用于取代传统的抗体。但是游离的核酸适配体血液循环半衰期太短和活体内稳定性低，限制了其活体应用。在一些临床批准的药物中，修饰疏水性脂质基团可以改善药物的药代动力学。疏水性的脂质尾巴可与血清中丰富的白蛋白结合，延长血液循环半衰期和增强稳定性。因此，设计脂质核酸适配体偶联物可显著改善核酸适配体的血液循环半衰期和稳定性。

在本研究中， PD-L1核酸适配体（apPDL1）被选择作为模式分子，通过修饰疏水性的C18链尾巴，用于癌症免疫成像和免疫治疗。脂质核酸适配体（C18-apPDL1）在不减弱与PD-L1蛋白亲和力的情况下，能够快速地与白蛋白结合，表现出延长的血液循环时间和增强的体内稳定性。放射性核素标记的C18-apPDL1作为核显像剂，显示出比apPDL1更强的肿瘤归巢能力，而且利用化疗药物奥沙利铂或X射线辐照上调肿瘤PD-L1表达后在肿瘤的富集同步增加，可在数小时短时间内快速直观地监测肿瘤内PD-L1表达的动态变化。此外，脂质核酸适配体，在相同质量剂量下具有媲美商业化PD-L1抗体的抗肿瘤能力。实验结果见图1-5。

图1 白蛋白结合型脂质核酸适配体用于肿瘤免疫成像和免疫治疗。脂质修饰的核酸适配体在静脉注射后迅速与血白蛋白结合，从而提高稳定性和延长血液循环时间。放射性标记的脂质适体可以监测肿瘤免疫标志物的动态变化，预测免疫治疗的响应。同时，脂质修饰的核酸适配体可以阻断PD-1和PD-L1的相互作用，用于肿瘤免疫治疗。

图2  白蛋白结合型脂质核酸适配体的合成和表征。(a）固相合成的脂质适配体与白蛋白结合的示意图。(b）apPDL1或C18-apPDL1与人血清白蛋白孵育后的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，C18-apPDL1的凝胶带延迟表明与白蛋白存在强烈的相互作用。(c）C18-apPDL1与不同浓度的人血清白蛋白孵育后聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

图3 核酸适配体与癌细胞的体外结合。流式细胞术分析B16细胞（a）、CT26细胞（b）和C1498细胞（c）与荧光标记的apPDL1、C18-apPDL1和C18 apRAN孵育后的结合。流式细胞术分析IFN-γ处理上调PD-L1表达后B16细胞（d）、CT26细胞（e）和C1498细胞（f）与荧光标记的C18-apPDL1孵育后的结合。（g）CT26细胞与荧光标记的C18-apPDL1孵育后激光共焦图像。

图4  ^99mTc标记的apPDL1、C18-apPDL1和C18 apRAN的SPECT成像（a）和生物分布（b）。PBS、X射线辐射和化疗药物奥沙利铂处理小鼠后，肿瘤PD-L1表达的免疫组化染色图像（c）和统计（d）。PBS、X射线辐射和化疗药物奥沙利铂处理小鼠后，^99mTc标记的C18-apPDL1的SPECT成像（c）和定量生物分布（d）。 

图5  PBS、apPDL1、PD-L1抗体和C18-apPDL1每隔天注射五次后（a），肿瘤生长曲线(b）和小鼠存活曲线(c）。（d）治疗后3天，小鼠肿瘤切片H&E和TUNEL染色。治疗后肿瘤内CD3⁺（e），CD4⁺（f）和CD8⁺（g）T细胞百分比，以及CD8⁺ T细胞在CD3⁺细胞中的百分比（h）。

这项工作通过DNA固相合成法成功地合成了脂质修饰的核酸适配体。脂质修饰的PD-L1核酸适配体可与血清白蛋白快速结合，而不会削弱其与PD-L1蛋白的结合亲和力。静脉注射后，脂质修饰的PD-L1核酸适配体具有延长的血液循环时间和增强的体内稳定性。由于与癌细胞高表达的PD-L1结合并显示出较强的肿瘤归巢能力，^99mTc标记的脂质修饰的PD-L1核酸适配可作为核成像显像剂，快速地监测化疗或放疗后肿瘤中PD-L1表达的动态变化。脂质修饰的PD-L1核酸适配体还能抑制肿瘤的生长，在相同质量剂量下可媲美商业化的PD-L1抗体。这项工作显示出核酸适配体在肿瘤免疫成像和免疫治疗中具有广阔的前景。

该论文第一作者为上海交通大学医学院附属仁济医院分子医学研究院博士后田龙龙，通讯作者为苏州大学刘庄教授和陈倩教授，该成果以“Albumin-Binding Lipid-Aptamer Conjugates for Cancer Immunoimaging and Immunotherapy”为题，最新在线发表于Sci. China Chem., 2021, 64, https://doi.org/10.1007/s11426-021-1168-4.

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